注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

儲存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
犬支原體探針法熒光定量PCR檢測試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

1,2,5,6-四吡啶細(xì)胞非蛋白/游離巰基含量熒光定量檢測試盒

1-β-D-呋喃核糖基尿嘧啶組織非蛋白/游離巰基含量熒光定量檢測試盒

1-酰哌啶體液非蛋白/游離巰基含量熒光定量檢測試盒

1-氧化-4-硝基吡啶植物非蛋白/游離巰基含量熒光定量檢測試盒

2-(4-芐基)吡啶真菌/酵母非蛋白/游離巰基含量熒光定量檢測試盒

2,2`-聯(lián)吡啶細(xì)菌非蛋白/游離巰基含量熒光定量檢測試盒

2,3-二氨基吡啶通用型蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

2,3-盧剔啶細(xì)胞蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

犬支原體探針法熒光定量PCR檢測試劑盒2,4,6-三基吡啶組織蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

2,4-二基吡啶體液蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

2,4-二羥基-5-羥基嘧啶植物蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

2,4-二羥基嘧啶真菌/酵母蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

2,5-盧剔啶細(xì)菌蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試盒

2,6-二基六吡啶通用型蛋白巰基/結(jié)合巰基含量熒光定量檢測試盒

2,6-二吡啶細(xì)胞蛋白巰基/結(jié)合巰基含量熒光定量檢測試盒己烯雌酚，純品型，標(biāo)準(zhǔn)品,有證書6898-97-1,56-53-1己烯雌酚，純品型，標(biāo)準(zhǔn)品,有證書 ,0.1g

己烯雌酚，純品型，標(biāo)準(zhǔn)品,有證書6898-97-1,56-53-1己烯雌酚，純品型，標(biāo)準(zhǔn)品,有證書 ,0.1g

己磺酸鈉5g

己雌酚-d4Hexestrol-d41mg

己酸酯(C6:0)141-78-6己酸酯(C6:0),標(biāo)準(zhǔn)品，有證書 ,100mg/500mg/1gm/5gm/10gm

己酸鈉(C6:0)10051-44-2己酸鈉(C6:0),標(biāo)準(zhǔn)品，有證書 ,100mg/500mg/1gm/5gm/10gm/25gm

己酸酯(C6:0)79-20-9己酸酯(C6:0),標(biāo)準(zhǔn)品，有證書 ,100mg/500mg/1gm/5gm/10gm

己酸酯 Methyl Caproate106-70-71ml/支，供脂肪酸組成檢查用

己酸酯 Methyl Caproate106-70-71ml/支，供脂肪酸組成檢查用

己酸膽固醇酯/膽固醇己酸酯(C6:0)1062-96-0己酸膽固醇酯/膽固醇己酸酯(C6:0),標(biāo)準(zhǔn)品，有證書 ,100mg/500mg/1gm